高血压是以血压升高为主要特点的全身性疾病，是导致冠心病、脑卒中等心血管疾病的主要原因之一。抑制血管紧张素转化酶（ACE）活性是非常有效的治疗策略。生物活性肽主要由2～20 个氨基酸残基组成，具有易吸收、致敏性低、溶解性好的特点，兼具营养补充和生理调节功能，大量来自天然蛋白质的活性肽具有ACE抑制活性。
中华鳖（Pelodiscus sinensis Wiegmann）又名王八、团鱼、甲鱼和水鱼，属于卵生两栖类爬行动物，主要分布于我国太湖流域，是传统滋补佳品，风味鲜香，有较高的食用价值。鳖蛋黄富含生物活性肽，目前已经从其酶解液中分离纯化出多种活性肽，其中包含ACE抑制活性肽。
广西中医药大学药学院的刘华宇，廖彭莹* ，广西中医药大学广西高校中药提取纯化与质量分析重点实验室的李耀华*等以ACE抑制活性为筛选指标，从鳖蛋黄酶解物中筛选活性组分，进行肽段鉴定，将生物信息学工具用于肽段的活性预测，旨在更高效地发现ACE抑制活性肽，同时结合活性验证与分子对接研究，进一步评价活性肽的体外作用效果与作用机制，加强对鳖蛋黄食疗保健价值的深入研究。
1鳖蛋黄蛋白质、脂肪及灰分含量
结果表明，脱脂鳖蛋黄蛋白质量分数为69.40%，脂肪质量分数仅为3.14%，灰分质量分数为7.46%，说明脱脂鳖蛋黄是一种高蛋白、低脂肪的原料，其含量丰富的蛋白质中含有大量活性肽有待挖掘。
2鳖蛋黄氨基酸组成
脱脂鳖蛋黄的氨基酸组成分析结果如表1所示。除色氨酸在水解过程中被破坏未检出外，共检出17 种氨基酸，其总质量分数为64.30%，必需氨基酸总质量分数为24.37%，其丰富的含量表明脱脂鳖蛋黄是理想的营养来源。脱脂鳖蛋黄必需氨基酸总量/氨基酸总量为0.38，必需氨基酸总量/非必需氨基酸总量为0.78，符合联合国粮农组织/世界卫生组织的理想蛋白质模式，表明其为优质蛋白质。有研究表明，Asp、Glu、Phe、Lys 4 种氨基酸可作为药用氨基酸添加利用，鳖蛋黄中含有大量Glu与Asp，在药物开发利用上具有一定的应用前景，同时Glu和Asp均属于酸性氨基酸，带负电荷，可螯合ACE活性中心带有正电荷的锌离子，抑制ACE活性。另外，疏水性氨基酸、芳香族氨基酸的存在有助于增强肽段的ACE抑制活性。
3酶解物的水解度和ACE抑制活性
如图1所示，菠萝蛋白酶酶解物的水解度最高，为（17.70±0.34）%，显著高于其余4 种蛋白酶酶解物（P＜0.05）。酶解物质量浓度为2 mg/mL时，菠萝蛋白酶酶解物的ACE抑制率也最高，为（82.63±0.34）%，测定其半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值为（0.210±0.019）mg/mL，显著高于其余4 种蛋白酶酶解物（P＜0.05）。菠萝蛋白酶属于巯基水解蛋白酶，在疏水氨基酸残基和非极性氨基酸残基上都具有酶解特异性，酶解后更易产生具有ACE抑制活性的肽。综合考虑水解度和ACE抑制活性，选择菠萝蛋白酶作为本研究中最适蛋白酶。
4超滤法分离结果
超滤是一种膜分离技术，在多肽分离中，超滤可以有效去除不溶性底物、大分子蛋白和多肽，获得分子质量较小的生物活性肽。如图2所示，经超滤后，所得分子质量＜3 kDa、3～10 kDa组分的ACE抑制率均显著高于菠萝蛋白酶酶解物的ACE抑制率（P＜0.05），这是由于低分子质量组分的肽链较短，空间位阻小，更易进入ACE活性口袋，从而改变ACE的催化活性。本研究中，分子质量＜3 kDa的组分ACE抑制率最高，为（93.52±0.02）%，测得其IC50值为（0.160±0.008）mg/mL，对其进行进一步纯化。
5Sephadex G-25色谱法分离结果
本研究中，将超滤所得分子质量＜3 kDa组分经Sephadex G-25色谱分离，获得3 个组分（F1、F2和F3），测定各组分的ACE抑制率，结果如图3、4所示。其中组分F3的ACE抑制率最高，显著高于组分F1、F2（P＜0.05），测得其IC50值为（0.100 0±0.000 4）mg/mL，选择组分F3进一步研究。
6肽段鉴定
活性组分F3经过LC-MS/MS分析，用Xcalibur软件解析，得到总离子流图，结果如图5所示。利用PEAKS Studio软件鉴定F3中的肽段，去除鉴定得分低于20及峰面积为0的肽段后，共得到36 条肽段，结果见表2。已鉴定的36 条肽段分子质量范围为742.42～1 280.55 Da，氨基酸序列长度集中于7～12。目前已经筛选的ACE抑制活性肽大部分分子质量＜3 kDa。对已鉴定的36 条肽段的C/N端氨基酸残基进行分析，结果如图6所示。C端氨基酸残基主要为Lys和Leu，研究表明，Leu的存在可增强肽段的ACE抑制活性，Lys为碱性氨基酸，也有助于增强肽段的ACE抑制活性；N端氨基酸残基主要为Asn、Ala、Tyr等。Tyr和Ala均属于疏水性氨基酸，疏水性氨基酸残基的存在有益于增强肽段的ACE抑制活性。
7肽段的生物信息学分析结果
PeptideRanker中生物活性评分＞0.5的肽一般被认为具有潜在生物活性，评分越高，表明该肽段具有生物活性的概率较高。从36 条肽段中筛选出PeptideRanker＞0.5的肽共有8 条，对其进行进一步分析，结果见表3。用Innovagen程序进行水溶性预测，其中6 条肽段水溶性好。肽段毒性预测结果显示均无毒性；进行HIA和潜在ACE抑制活性预测，均表现出人体肠道吸收良好且具有潜在的ACE抑制活性。
8肽段体外ACE抑制活性
对6 条水溶性好的肽段进行固相合成和体外ACE抑制活性验证，结果见图7。其中肽AK-7、SK-8无ACE抑制活性，另外4 条肽在质量浓度为1 mg/mL时均具有不同程度的ACE抑制活性，其中肽YD-8和AK-8具有较好的ACE抑制活性，显著高于肽SL-7、DL-7（P＜0.05），IC50值分别为（0.019 00±0.000 36）、（0.170 0±0.001 3）mg/mL。肽YD-8和AK-8的二级质谱图如图8所示。
ACE抑制肽的活性与其氨基酸残基组成密切相关，肽YD-8的C端存在带负电荷的酸性氨基酸残基Asp，可与ACE活性中心的Zn2+结合，从而增强肽段的ACE抑制活性。肽AK-8的C端存在碱性氨基酸残基Lys，也有助于增强其ACE抑制活性。肽YD-8和AK-8均包括大量疏水性氨基酸残基，其总比例分别为37.50%和50.00%，同时均包含Pro残基，有助于增强ACE抑制活性。
9影响黑曲曲胚风味形成的关键生物因子
如图9和表4所示，当对接能＜0时，结合能相对越高，表示结合越紧密。肽YD-8和AK-8与ACE的结合能分别为-8.5、-8.4 kJ/mol，说明这2 个肽均能与ACE产生较强的作用力。氢键对于肽与ACE的结合具有重要意义，肽YD-8与ACE共形成10 条氢键；肽AK-8与ACE形成8 条氢键。肽YD-8与ACE结合能更低，形成更多氢键，表明其与ACE作用力更强，这可能是其ACE抑制活性更强的原因之一。
10模拟胃肠道消化结果
肽YD-8和AK-8经模拟胃肠道消化均产生多种肽段。YD-8经模拟消化后生成肽NGIWPRD、YNGIW、PRD、YNGIWPR；肽AK-8经模拟消化后生成肽ASDIL、ASDILPK。
结论
本研究以脱脂鳖蛋黄为研究对象，首先对其主要成分和氨基酸组成进行分析，然后以水解度和ACE抑制活性为评价指标，筛选出菠萝蛋白酶作为最适蛋白酶。对酶解物中的ACE抑制肽类组分进行分离纯化，结果表明，组分F3具有最高的ACE抑制活性，其IC50值为（0.100 0±0.000 4）mg/mL。采用LC-MS/MS对其进行肽序列鉴定，共鉴定出36 条肽段，其分子质量均＜3 kDa。对鉴定出的肽段利用生物信息学方法进行活性和理化性质预测，优选出6 条肽段进行固相合成，进行体外ACE抑制活性验证。肽YD-8和AK-8具有较强的ACE抑制活性，其IC50值分别为（0.019 00±0.000 36）、（0.170 0±0.001 3）mg/mL。分子对接结果表明，肽YD-8和AK-8均能与ACE形成多条氢键，产生相互作用。模拟胃肠道消化结果表明，二者经胃肠酶消化后能产生多条具有ACE抑制活性的肽。肽YD-8具有更强的体外ACE抑制活性，后续可对其进行体内动物实验，进一步探究其作用效果与作用机制。
本研究将生物信息学应用于鳖蛋黄中ACE抑制肽的活性预测与筛选，提高了研究效率，从中发现2 条新的ACE抑制肽，促进了对鳖蛋黄食疗保健价值的深入研究。
本文《鳖蛋黄血管紧张素转化酶抑制肽分离纯化及活性分析》来源于《食品科学》2025年46卷第1期40-48，作者：刘华宇，廖彭莹*，张天丰，张新锐，邓纭宁，李耀华*，韦金锐，陈 俊。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231219-160。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
血压是以血压升高为主要特点的全身性疾病，是导致冠心病、脑卒中等心血管疾病的主要原因之一。抑制血管紧张素转化酶（ACE）活性是非常有效的治疗策略。生物活性肽主要由2～20 个氨基酸残基组成，具有易吸收、致敏性低、溶解性好的特点，兼具营养补充和生理调节功能，大量来自天然蛋白质的活性肽具有ACE抑制活性。
中华鳖（Pelodiscus sinensis Wiegmann）又名王八、团鱼、甲鱼和水鱼，属于卵生两栖类爬行动物，主要分布于我国太湖流域，是传统滋补佳品，风味鲜香，有较高的食用价值。鳖蛋黄富含生物活性肽，目前已经从其酶解液中分离纯化出多种活性肽，其中包含ACE抑制活性肽。
广西中医药大学药学院的刘华宇，廖彭莹* ，广西中医药大学广西高校中药提取纯化与质量分析重点实验室的李耀华*等以ACE抑制活性为筛选指标，从鳖蛋黄酶解物中筛选活性组分，进行肽段鉴定，将生物信息学工具用于肽段的活性预测，旨在更高效地发现ACE抑制活性肽，同时结合活性验证与分子对接研究，进一步评价活性肽的体外作用效果与作用机制，加强对鳖蛋黄食疗保健价值的深入研究。
1鳖蛋黄蛋白质、脂肪及灰分含量
结果表明，脱脂鳖蛋黄蛋白质量分数为69.40%，脂肪质量分数仅为3.14%，灰分质量分数为7.46%，说明脱脂鳖蛋黄是一种高蛋白、低脂肪的原料，其含量丰富的蛋白质中含有大量活性肽有待挖掘。
2鳖蛋黄氨基酸组成
脱脂鳖蛋黄的氨基酸组成分析结果如表1所示。除色氨酸在水解过程中被破坏未检出外，共检出17 种氨基酸，其总质量分数为64.30%，必需氨基酸总质量分数为24.37%，其丰富的含量表明脱脂鳖蛋黄是理想的营养来源。脱脂鳖蛋黄必需氨基酸总量/氨基酸总量为0.38，必需氨基酸总量/非必需氨基酸总量为0.78，符合联合国粮农组织/世界卫生组织的理想蛋白质模式，表明其为优质蛋白质。有研究表明，Asp、Glu、Phe、Lys 4 种氨基酸可作为药用氨基酸添加利用，鳖蛋黄中含有大量Glu与Asp，在药物开发利用上具有一定的应用前景，同时Glu和Asp均属于酸性氨基酸，带负电荷，可螯合ACE活性中心带有正电荷的锌离子，抑制ACE活性。另外，疏水性氨基酸、芳香族氨基酸的存在有助于增强肽段的ACE抑制活性。
3酶解物的水解度和ACE抑制活性
如图1所示，菠萝蛋白酶酶解物的水解度最高，为（17.70±0.34）%，显著高于其余4 种蛋白酶酶解物（P＜0.05）。酶解物质量浓度为2 mg/mL时，菠萝蛋白酶酶解物的ACE抑制率也最高，为（82.63±0.34）%，测定其半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值为（0.210±0.019）mg/mL，显著高于其余4 种蛋白酶酶解物（P＜0.05）。菠萝蛋白酶属于巯基水解蛋白酶，在疏水氨基酸残基和非极性氨基酸残基上都具有酶解特异性，酶解后更易产生具有ACE抑制活性的肽。综合考虑水解度和ACE抑制活性，选择菠萝蛋白酶作为本研究中最适蛋白酶。
4超滤法分离结果
超滤是一种膜分离技术，在多肽分离中，超滤可以有效去除不溶性底物、大分子蛋白和多肽，获得分子质量较小的生物活性肽。如图2所示，经超滤后，所得分子质量＜3 kDa、3～10 kDa组分的ACE抑制率均显著高于菠萝蛋白酶酶解物的ACE抑制率（P＜0.05），这是由于低分子质量组分的肽链较短，空间位阻小，更易进入ACE活性口袋，从而改变ACE的催化活性。本研究中，分子质量＜3 kDa的组分ACE抑制率最高，为（93.52±0.02）%，测得其IC50值为（0.160±0.008）mg/mL，对其进行进一步纯化。
5Sephadex G-25色谱法分离结果
本研究中，将超滤所得分子质量＜3 kDa组分经Sephadex G-25色谱分离，获得3 个组分（F1、F2和F3），测定各组分的ACE抑制率，结果如图3、4所示。其中组分F3的ACE抑制率最高，显著高于组分F1、F2（P＜0.05），测得其IC50值为（0.100 0±0.000 4）mg/mL，选择组分F3进一步研究。
6肽段鉴定
活性组分F3经过LC-MS/MS分析，用Xcalibur软件解析，得到总离子流图，结果如图5所示。利用PEAKS Studio软件鉴定F3中的肽段，去除鉴定得分低于20及峰面积为0的肽段后，共得到36 条肽段，结果见表2。已鉴定的36 条肽段分子质量范围为742.42～1 280.55 Da，氨基酸序列长度集中于7～12。目前已经筛选的ACE抑制活性肽大部分分子质量＜3 kDa。对已鉴定的36 条肽段的C/N端氨基酸残基进行分析，结果如图6所示。C端氨基酸残基主要为Lys和Leu，研究表明，Leu的存在可增强肽段的ACE抑制活性，Lys为碱性氨基酸，也有助于增强肽段的ACE抑制活性；N端氨基酸残基主要为Asn、Ala、Tyr等。Tyr和Ala均属于疏水性氨基酸，疏水性氨基酸残基的存在有益于增强肽段的ACE抑制活性。
7肽段的生物信息学分析结果
PeptideRanker中生物活性评分＞0.5的肽一般被认为具有潜在生物活性，评分越高，表明该肽段具有生物活性的概率较高。从36 条肽段中筛选出PeptideRanker＞0.5的肽共有8 条，对其进行进一步分析，结果见表3。用Innovagen程序进行水溶性预测，其中6 条肽段水溶性好。肽段毒性预测结果显示均无毒性；进行HIA和潜在ACE抑制活性预测，均表现出人体肠道吸收良好且具有潜在的ACE抑制活性。
8肽段体外ACE抑制活性
对6 条水溶性好的肽段进行固相合成和体外ACE抑制活性验证，结果见图7。其中肽AK-7、SK-8无ACE抑制活性，另外4 条肽在质量浓度为1 mg/mL时均具有不同程度的ACE抑制活性，其中肽YD-8和AK-8具有较好的ACE抑制活性，显著高于肽SL-7、DL-7（P＜0.05），IC50值分别为（0.019 00±0.000 36）、（0.170 0±0.001 3）mg/mL。肽YD-8和AK-8的二级质谱图如图8所示。
ACE抑制肽的活性与其氨基酸残基组成密切相关，肽YD-8的C端存在带负电荷的酸性氨基酸残基Asp，可与ACE活性中心的Zn2+结合，从而增强肽段的ACE抑制活性。肽AK-8的C端存在碱性氨基酸残基Lys，也有助于增强其ACE抑制活性。肽YD-8和AK-8均包括大量疏水性氨基酸残基，其总比例分别为37.50%和50.00%，同时均包含Pro残基，有助于增强ACE抑制活性。
9影响黑曲曲胚风味形成的关键生物因子
如图9和表4所示，当对接能＜0时，结合能相对越高，表示结合越紧密。肽YD-8和AK-8与ACE的结合能分别为-8.5、-8.4 kJ/mol，说明这2 个肽均能与ACE产生较强的作用力。氢键对于肽与ACE的结合具有重要意义，肽YD-8与ACE共形成10 条氢键；肽AK-8与ACE形成8 条氢键。肽YD-8与ACE结合能更低，形成更多氢键，表明其与ACE作用力更强，这可能是其ACE抑制活性更强的原因之一。
10模拟胃肠道消化结果
肽YD-8和AK-8经模拟胃肠道消化均产生多种肽段。YD-8经模拟消化后生成肽NGIWPRD、YNGIW、PRD、YNGIWPR；肽AK-8经模拟消化后生成肽ASDIL、ASDILPK。
结论
本研究以脱脂鳖蛋黄为研究对象，首先对其主要成分和氨基酸组成进行分析，然后以水解度和ACE抑制活性为评价指标，筛选出菠萝蛋白酶作为最适蛋白酶。对酶解物中的ACE抑制肽类组分进行分离纯化，结果表明，组分F3具有最高的ACE抑制活性，其IC50值为（0.100 0±0.000 4）mg/mL。采用LC-MS/MS对其进行肽序列鉴定，共鉴定出36 条肽段，其分子质量均＜3 kDa。对鉴定出的肽段利用生物信息学方法进行活性和理化性质预测，优选出6 条肽段进行固相合成，进行体外ACE抑制活性验证。肽YD-8和AK-8具有较强的ACE抑制活性，其IC50值分别为（0.019 00±0.000 36）、（0.170 0±0.001 3）mg/mL。分子对接结果表明，肽YD-8和AK-8均能与ACE形成多条氢键，产生相互作用。模拟胃肠道消化结果表明，二者经胃肠酶消化后能产生多条具有ACE抑制活性的肽。肽YD-8具有更强的体外ACE抑制活性，后续可对其进行体内动物实验，进一步探究其作用效果与作用机制。
本研究将生物信息学应用于鳖蛋黄中ACE抑制肽的活性预测与筛选，提高了研究效率，从中发现2 条新的ACE抑制肽，促进了对鳖蛋黄食疗保健价值的深入研究。
本文《鳖蛋黄血管紧张素转化酶抑制肽分离纯化及活性分析》来源于《食品科学》2025年46卷第1期40-48，作者：刘华宇，廖彭莹*，张天丰，张新锐，邓纭宁，李耀华*，韦金锐，陈 俊。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231219-160。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
